摘要： 摘要:目的 建立简便的doggyboneDNA(dbDNA)制备技术路线,探讨dbDNA与传统质粒DNA基因表达与诱导 免疫反应的差异;利用dbDNA诱导人外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcell,PBMC)重编程为诱导性多 能干细胞(inducedpluripotentstemcell,iPSC);探索在iPSCAAVS1位点插入超长DNA片段的方案,并同时将Cas9表 达框定点插入dbDNA来源的iPSC腺相关病毒位点1(adeno-associatedvirussite1,AAVS1)安全港内,构建仅需输入目 的基因靶向单向导RNA(singleguideRNA,sgRNA)即可实现iPSC基因编辑的稳定细胞株。方法 利用Phi29DNA 聚合酶多重置换扩增、原核端粒酶TelN酶切及共价连接、限制性内切酶和外切酶去除骨架环,从而建立简便的dbDNA 制备技术路线,将dbDNA-GFP载体与pMax-dbDNA-GFP传统质粒载体分别电转至PBMC,检测绿色荧光蛋白(green fluorescentprotein,GFP)表达效率,利用qPCR检测两组细胞干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)的mRNA表达水平;制备 dbDNA重编程载体dbDNA-MOS、dbDNA-KLF4、dbDNA-MYC及dbDNA-BCL并核转PBMC诱导重编程,通过形态 学、碱性磷酸酶染色、RT-PCR以及干细胞多能性标志物检测来鉴定dbDNA-iPSC细胞系;在iPSCAAVS1位点利用 ZFN与TALEN基因编辑技术插入11.5kb的含有Cas9表达框、序列中引入终止密码子的EGFP读码框、真核细胞筛 选标记等元件的超长DNA片段,通过红色荧光检测、基因组PCR反应以及Westernblot等方法鉴定Cas9整合入 AAVS1位点的iPSC细胞株,将EGFP单链同源修复模板与EGFPsgRNA共转染阳性iPSC细胞株,靶向修复EGFP基 因中错误终止密码子,正确表达绿色荧光蛋白,从而验证Cas9蛋白的基因编辑能力。结果 成功制备dbDNA载体并利 用其实现基因表达,dbDNA表达GFP基因效率与传统质粒DNA表达效率相近,IFN-γ的mRNA表达水平dbDNA组 小于传统质粒DNA组;成功获取形态似人胚胎干细胞,碱性磷酸酶染色、多能性相关基因表达及干细胞多能性标志物 阳性的iPSC细胞系;并在该细胞系安全港AAVS1位点成功基因编辑插入超长片段CRISPR-Cas9基因编辑报道系统, 基因组PCR鉴定整合片段成功插入基因组,表达红色荧光蛋白,Westernblot证实Cas9蛋白成功表达,并成功修复EG FP基因,使细胞表达绿色荧光。结论 本研究成功建立了简便的dbDNA制备的技术路线,dbDNA载体基因表达效率 与传统质粒DNA无差异,诱导免疫反应较小;经形态学、碱性磷酸酶染色、RT-PCR以及干细胞多能性标志物鉴定获取 dbDNA来源的iPSC;成功在iPSCAAVS1安全港插入一个11.5kb的超长DNA片段,构建Cas9介导基因编辑的iPSC 稳定细胞株。 

中图分类号: 

• Q78